اصول ساندویچ الایزا
ساندویچ الایزا (یا سنجش ایمنی ساندویچ) رایج ترین فرمت است. این فرمت به دو آنتی بادی اختصاصی برای اپی توپ های مختلف آنتی ژن نیاز دارد.
به طور معمول از این دو آنتی بادی به عنوان جفت آنتی بادی همسان یاد می شود.
یکی از آنتی بادی ها روی سطح صفحه چند چاهک پوشانده شده و به عنوان آنتی بادی گیرنده برای تسهیل بی حرکتی آنتی ژن استفاده می شود. آنتی بادی دیگر مزدوج است و تشخیص آنتی ژن را تسهیل می کند
بهینه سازی روش های ساندویچ الایزا دشوار است و باید از آنتی بادی های جفت مورد آزمایش استفاده شود.
آنتی بادی ها در حال تشخیص اپی توپ های مختلف بر روی پروتئین هدف هستند بنابراین با اتصال آنتی بادی دیگر تداخل ندارند.
بنابراین ، ما قادر به تضمین آنتی بادی های خود در ساندویچ الایزا نیستیم ، مگر اینکه آنها به طور خاص آزمایش شده باشند
پروتکل
پوشش با آنتی بادی تسخیری
- 1. چاهک های میکروپلیت با پی وی سی که با آنتی بادی گیرنده با غلظت10-1 میکروگرم بر میلی لیتر در داخل پوشش دهید
بافر کربنات / بی کربنات (pH9.6).
برای مقدار کمتری آنتی بادی خاص با افزایش غلظت پروتئین نمونه 10 میلی گرم در میلی لیتر را امتحان کنید
- 2. میکروپلیت را با پلاستیک چسبی بپوشانید و یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
- 3. محلول پوشش را برداشته و صفحه را دو بار با پر كردن چاهک ها با 200 میکرولیتر PBS بشویید. محلول ها یا شستشوها هستند
با تکان دادن صفحه روی ظرفشویی برداشته می شود. قطره های باقیمانده با لمس صفحه روی حوله کاغذی برداشته می شوند.
مسدود کردن و افزودن نمونه ها با ساندویچ الایزا
4- با افزودن 200 میکرولیتر بافر مسدود کننده ، 5٪ شیر خشک بدون چربی / PBS ، محل های باقی مانده اتصال پروتئین را در چاهک های پوشش داده شده مسدود کنید.
در هر چاهک
- 5. صفحه را با پلاستیک چسب پوشانده و حداقل 1-2 ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید یا در صورت راحت تر ،یک شب در دمای 4 درجه سانتی گراد باشد
- 6. به هر چاهک 100 میکرولیتر نمونه رقیق شده مناسب اضافه کنید. برای نتایج کمی دقیق ، همیشه سیگنال را مقایسه کنید
نمونه های ناشناخته در برابر منحنی استاندارد. استاندارد ها (نسخه های تکراری یا سه برابر) و خالی باید با آنها اجرا شود
هر صفحه برای اطمینان از صحت به مدت 90 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
برای تعیین کمیت ، غلظت استاندارد مورد استفاده باید پویا ترین تشخیص را داشته باشد
محدوده اتصال آنتی بادی برای اطمینان از به دست آوردن ممکن است لازم باشد دامنه غلظت را بهینه کنید
یک منحنی استاندارد مناسب برای کمی سازی دقیق ، همیشه نمونه ها و استاندارد را به صورت تکراری اجرا کنید
- 7. نمونه ها را برداشته و میکروپلیت را دو بار با پر كردن چاهک ها با 200 میکرولیتر PBS بشویید.
انکوباسیون با آنتی بادی تشخیص و سپس آنتی بادی ثانویه
8- به هر چاهک 100 میکرولیتر آنتی بادی ردیابی رقیق اضافه کنید.
اطمینان حاصل کنید که آنتی بادی تشخیص ثانویه ، یک اپی توپ متفاوت از پروتئین مورد نظر را نسبت به آنتی بادی پوشش دهنده تشخیص می دهد.
این از تداخل در اتصال آنتی بادی جلوگیری می کند و اطمینان حاصل می کند که اپی توپ برای آنتی بادی دوم برای اتصال در دسترس است. تا جایی که امکان دارد از یک جفت تطبیقی آزمایش شده استفاده کنید.
- 9. میکروپلیت را با پلاستیک چسب پوشانده و به مدت 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید.
- 10. میکروپلیت را چهار بار با PBS بشویید.
- 11. بلافاصله قبل از استفاده 100 میکرولیتر آنتی بادی ثانویه کونژوگه ، رقیق شده در غلظت مطلوب (طبق گفته سازنده) در بافر مسدود کننده اضافه کنید.
- 12. میکروپلیت را با پلاستیک چسب پوشانده و به مدت 1-2 ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید.
- میکروپلیت را چهار بار با PBS بشویید
– 100 .14 میکرولیتر (یا 50 میکرولیتر) از محلول بستر را در هر چاهک با یک پیپت چند کاناله یا چند پیپت پخش کنید.
ردیابی
اگرچه انواع مختلفی از آنزیم ها برای تشخیص استفاده شده است ، پراکسیداز تربچه اسب (HRP) و آلکالین فسفاتاز (ALP) دو آنزیم پرکاربرد در آزمایش ELISA هستند. در نظر گرفتن واقعیت مهم است
که برخی از مواد بیولوژیکی دارای سطح بالایی از فعالیت آنزیم درون زا هستند (مانند ALP بالا در سلولهای آلوئولی ، پراکسیداز در گلبولهای قرمز) و این ممکن است منجر به سیگنال غیر اختصاصی شود. در صورت لزوم ، مسدود کردن اضافی را انجام دهید
OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) محصول نهایی در 492 نانومتر اندازه گیری می شود. توجه داشته باشید که زیرلایه سبک است حسابستر HRP پراکسید هیدروژن است. شکاف پراکسید هیدروژن به اکسیداسیون یک اهدا کننده هیدروژن متصل می شود که در هنگام واکنش تغییر رنگ می دهد.
(TMB (3،3 ‘، 5،5’-tetramethylbenzidine) محلول TMB را به هر چاه اضافه کنید ، برای 15-30 دقیقه انکوباتور کنید ، حجم مساوی محلول توقف را اضافه کنید و تراکم نوری را در 450 نانومتر بخوانید بنابراین آن را در تاریکی نگهدارید و ذخیره کنید.
چگالی را می توان در 416 نانومتر اندازه گیری کرد.
توجه: برخی از سوبستراهای آنزیمی خطرناک (مواد سرطان زا بالقوه) محسوب می شوند ، بنابراین همیشه با احتیاط باشید ودست کش را بپوشید.
فیلم ساندویچ الایزا