کشت سلول

آلودگی کشت‌های سلولی به راحتی شایع‌ترین مشکلی است که در آزمایشگاه‌های کشت سلولی با آن مواجه می‌شویم و گاهی اوقات عواقب بسیار جدی در پی دارد. آلاینده‌های کشت سلولی را می‌توان به دو دسته اصلی، آلاینده‌های شیمیایی مانند ناخالصی‌های موجود در محیط، سرم و آب شامل اندوتوکسین‌ها، نرم‌کننده‌ها و مواد شوینده و آلاینده‌های بیولوژیکی مانند باکتری‌ها، کپک‌ها، مخمرها، ویروس‌ها و مایکوپلاسماها تقسیم کرد. به عنوان آلودگی متقابل توسط رده های سلولی دیگر است . در حالی که حذف کامل آلودگی غیرممکن است، می توان با به دست آوردن درک کامل از منابع آنها و با پیروی از تکنیک خوب آسپتیک، فراوانی و جدیت آن را کاهش داد. در این بخش مروری بر انواع عمده آلودگی بیولوژیکی ارائه می شود.

آلودگی کشت سلول با میکروب

باکتری ها گروه بزرگ و همه جا از میکروارگانیسم های تک سلولی هستند. آنها معمولاً چند میکرومتر قطر دارند و می توانند اشکال مختلفی داشته باشند، از کره ای  گرفته تا میله و مارپیچ هست  به دلیل وجود در  همه جا، اندازه و سرعت رشد سریع، باکتری ها، در مقایسه با مخمرها و کپک ها، رایج ترین آلاینده های بیولوژیکی هستند که در کشت سلولی با آن مواجه می شوند. آلودگی باکتریایی به راحتی با بازرسی بصری کشت ظرف چند روز پس از آلوده شدن آن شناسایی می شود. کشت های آلوده معمولاً کدر به نظر می رسند، گاهی اوقات با یک لایه نازک روی سطح هستند  افت ناگهانی در pH محیط کشت نیز اغلب مشاهده می شود. در یک میکروسکوپ کم قدرت، باکتری ها به صورت دانه های ریز بین سلول ها ظاهر می شوند و مشاهده زیر یک میکروسکوپ با قدرت بالا می تواند اشکال تک تک باکتری ها را مشخص کند.

تصاویر شبیه سازی شده با کنتراست فاز از 293 سلول چسبنده آلوده به E. coli. فضاهای بین سلول های چسبنده گرانول های ریز و درخشان را در زیر میکروسکوپ کم توان نشان می دهد، اما تک تک باکتری ها به راحتی قابل تشخیص نیستند (پانل A). بزرگنمایی بیشتر ناحیه محصور شده توسط مربع سیاه، سلول های  اکلای را که معمولاً میله ای شکل هستند و حدود 2 میکرومتر طول و 0.5 میکرومتر قطر دارند،

آلودگی کشت با مخمرها :

مخمرها میکروارگانیسم‌های یوکاریوتی تک سلولی در قلمرو قارچ‌ها هستند که اندازه آنها از چند میکرومتر (معمولا) تا 40 میکرومتر (به ندرت) متغیر است. مانند آلودگی باکتریایی، کشت های آلوده به مخمر کدر می شوند، به خصوص اگر آلودگی در مرحله پیشرفته باشد. تغییر بسیار کمی در pH کشت آلوده به مخمر تا زمانی که آلودگی سنگین شود، در این مرحله معمولاً pH افزایش می یابد. در زیر میکروسکوپ، مخمر به صورت ذرات بیضی شکل یا کروی ظاهر می شود که ممکن است ذرات کوچکتری را جوانه بزنند.

آلودگی کشت با کپک ها :

کپک ها میکروارگانیسم های یوکاریوتی در قلمرو قارچ ها هستند که به صورت رشته های چند سلولی به نام هیف رشد می کنند. شبکه‌ای از این رشته‌های چند سلولی حاوی هسته‌های ژنتیکی یکسان هستند و به آنها کلنی یا میسلیوم می‌گویند. مشابه آلودگی مخمری، pH کشت در مراحل اولیه آلودگی ثابت می ماند، سپس به سرعت افزایش می یابد زیرا کشت به شدت آلوده می شود و کدر می شود. در زیر میکروسکوپ، میسلیوم ها معمولاً به صورت رشته های نازک و ضخیم و گاهی متراکم تر ظاهر می شوند.
توده هاگ هاگ های بسیاری از گونه های کپک می توانند در محیط های بسیار خشن و نامناسب در مرحله خواب خود زنده بمانند، فقط در صورت مواجهه با شرایط رشد مناسب فعال می شوند.

آلودگی کشت با ویروس ها:

ویروس ها عوامل عفونی میکروسکوپی هستند که ماشین آلات سلول میزبان را برای تولید مثل در اختیار می گیرند. اندازه بسیار کوچک آنها تشخیص آنها را در کشت و حذف آنها از معرفهای مورد استفاده در آزمایشگاههای کشت سلولی بسیار دشوار می کند. از آنجایی که بیشتر ویروس‌ها نیازمندی‌های بسیار سخت‌گیرانه‌ای برای میزبان خود دارند، معمولاً روی کشت‌های سلولی گونه‌هایی غیر از میزبان خود تأثیر منفی نمی‌گذارند. با این حال، استفاده از کشت های سلولی آلوده به ویروس می تواند یک خطر جدی برای سلامت پرسنل آزمایشگاه ایجاد کند، به خصوص اگر سلول های انسان یا پستانداران در آزمایشگاه کشت شوند. عفونت ویروسی کشت های سلولی را می توان با میکروسکوپ الکترونی، رنگ آمیزی ایمنی با پانل آنتی بادی، سنجش ELISA یا PCR با پرایمرهای ویروسی مناسب تشخیص داد.

آلودگی با مایکوپلاسما :

مایکوپلاسماها باکتری های ساده ای هستند که فاقد دیواره سلولی هستند و کوچکترین ارگانیسم خودتکثیر شونده در نظر گرفته می شوند. به دلیل اندازه بسیار کوچک آنها (معمولاً کمتر از 1 میکرومتر)، شناسایی مایکوپلاسماها تا زمانی که به تراکم بسیار بالایی دست یابند و باعث تخریب کشت سلولی شوند بسیار دشوار است. تا آن زمان، اغلب هیچ نشانه قابل مشاهده ای از عفونت وجود ندارد. برخی از مایکوپلاسماهای با رشد آهسته ممکن است بدون ایجاد مرگ سلولی در کشت باقی بمانند، اما می توانند رفتار و متابولیسم سلول های میزبان در کشت را تغییر دهند.
عفونت‌های مزمن مایکوپلاسما ممکن است خود را با کاهش نرخ تکثیر سلولی، کاهش چگالی اشباع و آگلوتیناسیون در کشت‌های سوسپانسیون نشان دهند. با این حال، تنها راه مطمئن برای تشخیص آلودگی به مایکوپلاسما، آزمایش دوره‌ای کشت‌ها با استفاده از رنگ‌آمیزی فلورسنت (مانند رنگ‌آمیزی Hoechst 33258)، الایزا، PCR، رنگ‌آمیزی ایمنی، اتورادیوگرافی، یا سنجش‌های میکروبیولوژیکی است.

آلودگی متقاطع کشت سلول :

در حالی که به اندازه آلودگی میکروبی رایج نیست، آلودگی متقاطع گسترده بسیاری از رده های سلولی با HeLa و سایر رده های سلولی با رشد سریع، یک مشکل آشکار با عواقب جدی است. دریافت خطوط سلولی از بانک‌های سلولی معتبر، بررسی دوره‌ای ویژگی‌های خطوط سلولی و انجام تکنیک‌های خوب آسپتیک، اقداماتی هستند که به شما در جلوگیری از آلودگی متقاطع کمک می‌کنند. انگشت نگاری DNA، تجزیه و تحلیل کاریوتایپ، و آنالیز ایزوتیپ می تواند وجود یا عدم وجود آلودگی متقاطع را در کشت های سلولی شما  را تایید کند.

استفاده از آنتی بیوتیک برای آلودگی کشت سلول :

آنتی بیوتیک ها هرگز نباید به طور معمول در کشت سلولی مورد استفاده قرار گیرند، زیرا استفاده مداوم از آنها باعث ایجاد سویه های مقاوم به آنتی بیوتیک می شود و اجازه می دهد تا آلودگی در سطح پایین باقی بماند، که می تواند پس از حذف آنتی بیوتیک از محیط به آلودگی در مقیاس کامل تبدیل شود و ممکن است پنهان شود. عفونت های مایکوپلاسما و سایر آلاینده های پنهان علاوه بر این، برخی از آنتی بیوتیک ها ممکن است با سلول ها واکنش متقابل داشته باشند و با فرآیندهای سلولی مورد بررسی تداخل کنند.
آنتی بیوتیک ها فقط باید به عنوان آخرین راه حل و فقط برای کاربردهای کوتاه مدت استفاده شوند و باید در اسرع وقت از کشت حذف شوند. اگر آنها در طولانی مدت استفاده شوند، کشت های عاری از آنتی بیوتیک باید به طور موازی به عنوان کنترلی برای عفونت های مرموز نگهداری شوند.