پرایمر یک اسید نوکلئیک تک رشته ای کوتاه است که توسط همه موجودات زنده در آغاز سنتز DNA استفاده می شود.
آنزیم های DNA پلیمراز (مسئول تکثیر DNA) فقط قادر به افزودن نوکلئوتید به انتهای 3’ اسید نوکلئیک موجود هستند و قبل از اینکه DNA پلیمراز یک رشته مکمل را شروع کند، نیاز به اتصال یک پرایمر به الگو است. موجودات زنده فقط از پرایمر RNA استفاده می کنند، در حالی که تکنیک های آزمایشگاهی در بیوشیمی و زیست شناسی مولکولی که نیاز به سنتز DNA آزمایشگاهی دارند (مانند تعیین توالی DNA و واکنش زنجیره ای پلیمراز) معمولاً از پرایمرهای DNA استفاده می کنند ، زیرا در دما پایدارتر هستند.
طراحی پرایمر برای PCR
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) از یک جفت پرایمرهای سفارشی برای هدایت طویل شدن DNA به سمت یکدیگر در انتهای مخالف توالی تقویت شده استفاده می کند. طول این پرایمرها معمولاً بین 18 تا 24 پایه است و باید فقط برای مکانهای خاص بالادست و پایین دست توالی تقویت شده کدگذاری شود. یک پرایمر که می تواند به چندین منطقه در امتداد DNA متصل شود ، همه آنها را تقویت کرده و هدف PCR را از بین می برد.
هنگام طراحی یک جفت پرایمر PCR باید چند معیار در نظر گرفته شود. جفت پرایمرها باید از درجه حرارت ذوب مشابهی برخوردار باشند زیرا عمل اتصال در حین PCR به طور همزمان برای هر دو رشته انجام می شود و این دمای ذوب اشتراکی نباید بیش از حد زیاد یا پایین تر از دمای اتصال واکنش باشد. یک پرایمر با Tm (دمای ذوب) خیلی بالاتر از دمای بازاتصال واکنش می تواند ترکیبی شود و در یک مکان نادرست در طول توالی DNA گسترش یابد. Tm قابل ملاحظه ای پایین تر از دمای بازپخت ممکن است کاملاً پخت نشود و گسترش یابد.
علاوه بر این ، توالی های پرایمر باید انتخاب شوند تا به طور منحصر به فرد برای منطقه ای از DNA انتخاب شوند، از احتمال هیبریداسیون به دنباله مشابه در نزدیکی جلوگیری شود. روشی که معمولاً برای انتخاب سایت پرایمر مورد استفاده قرار می گیرد جستجوی BLAST است که به موجب آن تمام مناطق ممکن که ممکن است یک پرایمر به آنها متصل شود دیده می شود. هر دو توالی نوکلئوتیدی و همچنین خود پرایمر را می توان BLAST جستجو کرد. ابزار رایگان NCBI Primer-BLAST همانند محصولات نرم افزاری تجاری مانند ePrime و Beacon Designer ، طراحی پرایمر و جستجوی BLAST را در یک برنامه ادغام می کند. شبیه سازی رایانه ای نتایج PCR نظری (PCR الکترونیکی) ممکن است برای کمک به طراحی پرایمر با دادن دمای ذوب و بازاتصال و غیره انجام شود.
بسیاری از ابزارهای آنلاین به صورت رایگان برای طراحی پرایمر در دسترس هستند ، برخی از آنها بر روی برنامه های خاص PCR تمرکز دارند. از ابزارهای محبوب Primer3Plus و PrimerQuest می توان برای یافتن پرایمرهای متناسب با طیف گسترده ای از مشخصات استفاده کرد. پرایمرهایی بسیاری برای هدف قرار دادن طیف گسترده ای از الگوهای DNA را می توان با استفاده از GeneFISHER به صورت تعاملی طراحی كرد. پرایمرها با ویژگی بالا برای زیرمجموعه ای از الگوهای DNA در حضور بسیاری از انواع مشابه را می توان با استفاده از DECIPHER طراحی کرد. طراحی پرایمر هدف ایجاد تعادل بین ویژگی و کارایی تقویت است.
انتخاب یک منطقه خاص از DNA برای اتصال پرایمر به برخی از ملاحظات اضافی نیاز دارد. از مناطقی که دارای مونونوکلئوتید و تکرار دینوکلئوتید هستند باید اجتناب شود، زیرا تشکیل حلقه می تواند اتفاق بیفتد و به هیبریداسیون کمک کند. پرایمرها نباید به راحتی با سایر توالی ها اتصال پیدا کنند.این پدیده می تواند منجر به تولید محصولات “پرایمر دایمر ” شود که محلول نهایی را آلوده می کند. پرایمرها نباید به شدت به خودی خود متصل شوند شوند، زیرا حلقه های داخلی می توانند مانع بازاتصال با الگو DNA شوند.
هنگام طراحی پرایمرها، می توان پایه های نوکلئوتیدی اضافی را به انتهای پشت هر پرایمر اضافه کرد و در نتیجه یک ترتیب کلاهک سفارشی در هر انتهای منطقه تقویت شده ایجاد کرد. یکی از کاربردهای این روش استفاده در شبیه سازی TA است، یک روش خاص زیرکلونینگ مشابه PCR ، که در آن می توان با افزودن دم AG به انتهای 5 و 3 3 ، کارایی را افزایش داد.