الایزای رقابتی
الایزای رقابتی که در این روش به عنوان الایزا رقابتی مهار کننده یا سنجش ایمنی شناخته می شود ، با تشخیص تداخل سیگنال ، غلظت آنتی ژن را اندازه گیری می کند.
هر یک از فرمت های های قبلی را می توان با فرمت رقابتی سازگار کرد. آنتی ژن نمونه برای اتصال به مقدار مشخصی از آنتی بادی نشاندار با آنتی ژن مرجع رقابت می کند.
آنتی ژن مرجع از قبل روی چاهک های میکروپلیت پوشانده می شود.
نمونه از قبل با آنتی بادی دارای نشان انکوبه شده و به چاهک ها اضافه می شود. بسته به مقدار آنتی ژن موجود در نمونه ، کم و بیش آنتی بادی آزاد برای اتصال آنتی ژن مرجع در دسترس خواهد بود.
این بدان معناست که هرچه آنتی ژن موجود در نمونه بیشتر باشد ، آنتی ژن مرجع کمتری شناسایی و سیگنال ضعیف می شود.
برخی از کیت های الایزا رقابتی به جای آنتی بادی نشاندار از آنتی ژن دارای نشان استفاده می کنند. آنتی ژن نشاندار و آنتی ژن نمونه (بدون نشان) برای اتصال به آنتی بادی اولیه با هم رقابت می کنند.
هرچه مقدار آنتی ژن در نمونه کمتر باشد ، سیگنال به دلیل وجود آنتی ژن دارای نشان بیشتری در چاهک ها ، قوی تر می شود.
معرف های مورد نیاز پروتکل الایزای رقابتی
- پوشش بافر Na2CO3 بدون آب ، 1.5 گرم
- NaHCO3 بی آب ، 2.93 گرم
- آب مقطر ، 1 لیتر ، pH تا 9.6
برای یک بافر پوشش جایگزین از بافر پوشش ELISA (BUF030) استفاده کنید
- بافر مسدود کننده سالین بافر فسفات (PBS) حاوی 1٪ w / v BSA
- برای استفاده از یک بافر شستشو ، از بافر شستشوی ELISA (BUF031) Substrates و Stop SolutionsTMB Core + (BUF062) برای استفاده با آنتی بادی های متصل شده به HRP استفاده کنید. و با H2SO4 0.2 مولار متوقف شوید.
.
روش پروتکل الایزای رقابتی
_چاهک های صفحه میکروپلیت را با 100 میکرولیتر از محلول آنتی ژن ، با غلظت بین 1-10 میکروگرم در میلی لیتر در بافر پوشش قرار دهید. میکروپلیت را بپوشانید و یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه کنید. بشقاب را 3 بار در بافر شستشو بشویید.
_به هر چاه 150 میکرولیتر محلول مسدود کننده اضافه کنید. به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید. 4 بار در بافر شستشو بشویید.
_مخلوط آنتی بادی آنتی ژن را با افزودن 50 میکرولیتر آنتی ژن به 50 میکرولیتر آنتی بادی برای هر چاهک در آزمایش آماده کنید (از طیف وسیعی از غلظت آنتی ژن به طور مناسب در بافر شستشو استفاده کنید). به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
_100 میکرولیتر از مخلوط را به هر چاهک اضافه کنید.
_ به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید. 3 بار در بافر شستشو بشویید.
_100 میکرولیتر آنتی بادی ثانویه متصل به آنزیم (به طور مناسب در بافر شستشو رقیق شده) به هر چاهک اضافه کنید. به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید. 3 بار در بافر شستشو بشویید.
_100 میکرولیتر از محلول بستر مناسب را به هر چاهک اضافه کنید. در دمای اتاق (و در صورت نیاز در تاریکی) به مدت 30 دقیقه ، یا تا زمانی که تغییر رنگ مورد نظر حاصل شود ، انکوبه کنید.
_مقادیر جذب را بلافاصله در طول موج مناسب بخوانید با 50 میکرولیتر “محلول توقف” اضافه کنید. برای اطمینان از مخلوط شدن کامل ، به آرامی روی صفحه ضربه بزنید. میزان جذب نوری را در مدت 30 دقیقه اندازه گیری کنید.