اصول الایزای مستقیم(direct elisa)
در الایزای مستقیم آنتی ژن در سطح پلیت چاهک ها بی حرکت است
و با یک آنتی بادی مخصوص آنتی ژن که مستقیماً به HRP متصل است یا سایر مولکول های تشخیص داده می شود
الایزای مستقیم در زمینه پزشکی و صنایع غذایی به عنوان ابزار تشخیصی و کنترل کیفیت استفاده شده است. این فناوری به طور سنتی در صفحات پلی استایرن 96 چاهک یا 384 چاهک انجام می شود ، با افزایش اتوماسیون ، این فناوری به سیستم عامل های دیگر نیز گسترش یافته است.
پروتکل الایزای مستقیم
بافر پوشش بی کربنات / کربنات (100 میلی متر)
آنتی ژن یا آنتی بادی که باید در بافر پوشش رقیق شود تا در چاهک ها بی حرکت شود:
3.03 گرم Na2CO3 ،
6.0 گرم NaHCO3
1000 میلی لیتر آب مقطر
pH 9.6 ،
PBS
1.16 گرم Na2HPO4 ،
0.1 گرم KCl ،
0.1 گرم K3PO4 ،
4.0 گرم (NaCl 500میلی لیتر) آب مقطر( pH 7.4)
راه حل مسدود کردن
عوامل مسدود كننده معمولاً 1٪ BSA ، سرم ، شیر خشك بدون چربی ، كازئین ، ژلاتین در PBS هستند.
محلول شستشو
معمولاً PBS یا نمک بافر Tris (pH 7.4) همراه با مواد شوینده مانند 0.05٪ (v / v) Tween20 (TBST).
رقت بافر آنتی بادی الایزای مستقیم
آنتی بادی اولیه و ثانویه باید در محلول مسدود کننده 1 برابر رقیق شود تا اتصال غیر اختصاصی کاهش یابد.
روند عمومی
اتصال آنتی ژن به میکروپلیت
- 1. آنتی ژن را تا غلظت نهایی 20 میکروگرم بر میلی لیتر در PBS یا سایر بافرهای کربنات رقیق کنید. چاه ک های یک PVC را پوشش دهید
صفحه میکروتیتر با آنتی ژن با لوله گذاری 50 میکرولیتر از رقت آنتی ژن در چاهک های بالای صفحه رقیق کنید
پلیت های مورد نیاز
نمونه های آزمایشی حاوی آنتی ژن خالص معمولاً با فشار کمتر از 2 میلی گرم در میلی لیتر بر روی صفحه قرار می گیرند.
محلول های خالص ضروری نیستند ، اما به عنوان یک راهنما ، بیش از 3٪ پروتئین موجود در نمونه آزمایش را تشکیل می دهند
باید پروتئین هدف باشد. (آنتی ژن) غلظت پروتئین آنتی ژن نباید بیش از حد باشد
20 گرم در میلی لیتر زیرا این باعث اشباع شدن بیشتر مکان های موجود در صفحه میکروپلیت می شود.
اطمینان حاصل کنید که نمونه ها حاوی آنتی ژن در غلظت است که در محدوده تشخیص از
پادتن.
- 2. صفحه را با یک پلاستیک چسب پوشانده و به مدت 2 ساعت در دمای اتاق یا 4 درجه سانتیگراد در یک شب انکوبه کنید.
زمان انکوبه ممکن است به برخی از بهینه سازی ها نیاز داشته باشد.
- 3. محلول پوشش را برداشته و صفحه را دو بار با پر كردن چاه ها با 200 میکروپلیت PBS بشویید. محلول ها یا شستشوها هستند
با تکان دادن صفحه روی ظرفشویی برداشته می شود. قطره های باقیمانده با لمس صفحه روی حوله کاغذی برداشته می شوند.
مسدود کردن
4- با افزودن 200 میکرولیتر بافر مسدود کننده ، 5٪ شیر خشک بدون چربی / PBS ، محل های باقی مانده اتصال پروتئین را در چاهک های پوشش داده شده مسدود کنید.
در هر چاهک معرف های مسدود کننده جایگزین شامل BlockACE یا BSA هستند.
5-پلیت را با پلاستیک چسب پوشانده و حداقل 2 ساعت در دمای اتاق یا در صورت راحت تر بودن ، یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
- 6. پلیت را دو بار با PBS بشویید.
انکوبه با آنتی بادی در الایزای مستقیم
7 100 .میکرولیتر آنتی بادی را که در غلظت مطلوب رقیق شده (طبق دستورالعمل سازنده) در آن اضافه کنید
مسدود کردن بافر بلافاصله قبل از استفاده.
- 8. پلیت را با پلاستیک چسب پوشانده و به مدت 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید. این زمان انکوباسیون ممکن است نیاز داشته باشد
رنگ آمیزی اغلب هنگام انكوباسیون در طول شب در دمای 4 درجه سانتیگراد مشاهده می شود.
- 9. پلیت را چهار بار با PBS بشویید.
ردیابی
- 10. 100 میکرولیتر (یا 50 میکرولیتر) از محلول بستر را در هر چاه با یک پیپت چند کاناله یا چند ضربه پخش کنید.
- 11. پس از رشد کافی رنگ (در صورت لزوم) 100 میکرولیتر محلول توقف را به چاهک ها اضافه کنید.
- 12. میزان جذب (چگالی نوری) هر چاهک را با الایزا ریدیر بخوانید.
توجه: برخی از بسترهای آنزیمی خطرناک (مواد سرطان زا بالقوه) محسوب می شوند ، بنابراین همیشه آنها را با دقت کنترل کنید و دستکش بپوشید
تجزیه و تحلیل داده ها
یک منحنی استاندارد از داده های تولید شده از رقت های سریال با غلظت در محور x (مقیاس ورود به سیستم) در مقابل تهیه کنید
جذب در محور Y (خطی) غلظت نمونه را از این منحنی استاندارد تفسیر کنید.
انیمیشن الایزا مستقیم و غیر مستقیم