الایزای غیر مستقیم:(indirect Elisa)
الایزای غیر مستقیم هم مشابه سنجش های مستقیم الایزا ، آنتی ژن در سطح صفحه چند چاهک بی حرکت است.
با این حال ، یک فرایند دو مرحله ای برای الایزای غیر مستقیم تشخیص مورد نیاز است که به موجب آن یک آنتی بادی اولیه خاص برای آنتی ژن به هدف متصل می شود.
و یک آنتی بادی ثانویه برچسب زده شده علیه گونه میزبان آنتی بادی اولیه برای شناسایی به آنتی بادی اولیه متصل می شود
این روش همچنین می تواند برای شناسایی آنتی بادی های خاص در نمونه سرم با جایگزینی سرم برای آنتی بادی اولیه استفاده شود
از الایزا غیر مستقیم برای تخمین کمی آنتی بادی ها در سرم و سایر مایعات بدن استفاده می شود.
در این روش ، نمونه ها به چاهک های میکروپلیت تیتر پوشانده شده با آنتی ژنی که قرار است آنتی بادی های اختصاصی در آنها شناسایی شود ، اضافه می شوند.
پس از یک دوره انکوباسیون ، چاهک ها شسته می شوند. اگر آنتی بادی در نمونه وجود داشت ، کمپلکس آنتی ژن – آنتی بادی تشکیل می شد و از بین نمی رود.
از طرف دیگر ، اگر آنتی بادی اختصاصی در نمونه وجود نداشته باشد ، هیچ تشکیل پیچیده ای وجود ندارد.
سپس ، یک آنتی بادی ضد ایزوتایپ متصل به آنزیم اضافه شده و انکوبه می شوند. بعد از یک مرحله شستشو ، سوبسترا برای آنزیم اضافه می شود.
اگر در مرحله اولیه تشکیل کمپلکس وجود داشته باشد ، آنتی بادی ضد ایزوتایپ ثانویه به آنتی بادی اولیه متصل می شود و یک واکنش کروموژنیک بین آنزیم و سوبسترا به وجود می آید.
با اندازه گیری مقادیر چگالی نوری چاهک ها ، پس از افزودن محلول متوقف کننده برای متوقف کردن واکنش کروموژنیک ، می توان میزان کمپلکس آنتی ژن – آنتی بادی تشکیل شده در مرحله اول را تعیین کرد.
مزایای الایزا غیر مستقیم
حساسیت بالا: بیش از یک آنتی بادی نشاندار شده است به ازای هر مولکول آنتی ژن متصل می شود.
انعطاف پذیر: آنتی بادی های مختلف تشخیص اولیه را می توان با یک آنتی بادی ثانویه برچسب تک استفاده می شود.
صرفه جویی در هزینه: به آنتی بادی های نشاندار کم تر نیاز است
پروتکل الایزای غیر مستقیم:
1. صفحه میکروپلیت را با آنتی ژن بپوشانید: محلول آنتی ژن 50 میکرولیتر (معرف پوشش) را در چاهک های صفحه میکروپلیت پخش کنید.
2. صفحات روکش شده را در بسته بندی پلاستیکی بپیچید تا به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور گذاشته شود
3. پس از انکوباتور ، صفحه میکروپلیت را باز کرده و محلول را درون یک ظرف دور بریزید.
4. مرحله شستشو: محلول پوشش را برداشته و صفحه را دو بار با پر كردن چاه ها با 200 میکرولیتر PBS بشویید. محلول ها یا شستشوها با پیپت گذاری برداشته می شوند. قطره های باقیمانده با لمس صفحه روی حوله کاغذی برداشته می شوند.(مرحله چهارم الایزای غیر مستقیم)
5. مرحله انسداد: با افزودن 200 میکرولیتر بافر انسداد ، محل های باقی مانده اتصال پروتئین را در چاه های پوشش داده شده مسدود کرده و 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
6. محلول را دور بریزید و مرحله شستشو را انجام دهید. میکروپلیت را به آرامی روی حوله کاغذی بزنید
7. پنجاه میکرولیتر محلول آنتی بادی را با استفاده از میکروپیپت از ویال به چاهک ها اضافه کنید.
8. صفحه را در بسته بندی پلاستیکی بپیچید و به مدت 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید. 9. مایع و کف صفحه را با کاغذ جاذب خشک دور بریزید.
10. مرحله شستشو را تکرار کنید
11. مرحله مسدود کردن را تکرار کنید.
12. مرحله شستشو را تکرار کنید.
13. پنجاه میکرولیتر معرف آنتی بادی ثانویه به چاهک ها اضافه کنید.
14. صفحه میکروپلیت را در بسته بندی پلاستیکی بپیچید و 2 ساعت در دمای اتاق انکوب کنید.
15. مرحله شستشو را در الایزای غیر مستقیم تکرار کنید.
16. محلول بستر 75 میکروپلیت را از ویال به چاهک های موجود در میکروپلیت اضافه کنید.
17. صفحات میکروپلیت را در بسته بندی پلاستیکی بپیچید و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید.
18. محلول توقف 25 میکرولیتر ( 0/5 میلی لیتر) NaOH را از ویال به چاهک های موجود در میکروپلیت اضافه کنید.
19. برای اندازه گیری هیدرولیز از الایزا ریدیر با طول موج 405 نانومتر استفاده می شود .