تولید لنفوسیت های T از سلول های بنیادی

لنفوسیت های T

تولید  لنفوسیت های  (T  ( lymphocyt  از سلول های بنیادی پرتوان (PSC) توانایی ایجاد جمعیت های همگن سلول های لنفوسیت  T را دارند که می توانند در مقیاس بالینی رشد کرده و برای تأمین نیازهای خاص بالینی از نظر ژنتیکی مهندسی شوند.

OP9-DLL4 ، یک خط استرومائی که به صورت خارج رحمی لیگاند ناچ Delta-like 4 (DLL4) را بیان می کند ، برای پشتیبانی از تمایز PSC به لنفوسیت های T استفاده می شود.

در این مقاله چندین پروتکل مربوط به تولید سلول های T از PSC های انسان و اجرام اولیه (NHP) انسان شامل اجزا اولیه خونسازی PSC در فیدرهای OP9 یا شرایط تعریف شده و به دنبال آن کشت سلول های OP9-DLL4 با سلول های PSC مشتق شده است.

اجداد خون ساز (HP) ، که منجر به تمایز کارآمد به لنفوسیت های T می شود. علاوه بر این ، ما یک پروتکل برای تولید سلول T قوی از HPSCs شرط بیان ETS1 را توصیف می کنیم. پروتکل های ارائه شده بستری را برای تولید سلول T برای مدل سازی بیماری و ارزیابی کاربرد آنها برای ایمنوتراپی در مدل های حیوانات بزرگ فراهم می کند.

زمینه

لنفوسیت های T (سلولهای T) نقش مهمی در پاسخ های ایمنی با واسطه سلولی دارند و در نظارت و کشتن سلول های توموری نقش دارند.

در طول دهه های اخیر ، چندین استراتژی برای هدایت ، فرهنگ سازی و / یا تقویت لنفوسیت های T در برابر سرطان ایجاد شده است (Houot et al.، 2015؛ ژوئن و همکاران ، 2018) و استفاده از آنها برای ایمونوتراپی های مبتنی بر سلول های لنفوسیت  T است .

کارآزمایی های بالینی اخیر نتایج برجسته ای را در بیماران مبتلا به لنفوم عودکننده و مقاوم به درمان نشان داده شده با سلولهای گیرنده آنتی ژن (Car) آنتی ژن chimeric) T) نشان داده شده است (Riviere and Sadelain، 2017).

سلول های بنیادی پرتوان انسان (hPSCs) ، از جمله جنین (hESCs) و القا شده (hiPSCs) ، منبع امیدوار کننده ای را برای تولید لنفوسیت های T برای ایمنوتراپی سلولی فراهم می کنند ، که می تواند با فن آوری های مهندسی ژنتیک همراه سلول های  باشد

CTL های جدید گزارش های متعددی نسل سلول T را از hPSC ها نشان داده اند (و امکان سنجی روش های درمانی سلول های CAR T مبتنی بر hiPSC  سنجیده اند با این حال،هنوز نیاز به بهبود کارایی سلول های T وجود دارد وگسترش از hPSC ها. علاوه بر این ، پیشرفت های بیشتر  مبتنی بر hPSC است.

روش های درمانی سلول های T به ارزیابی بالینی آنها در مدل های حیوانی بزرگ احتیاج دارند.

از آنجا که موش ها  از نظر فیزیولوژیکی و ایمنی از نظر انسانی شبیه به انسان هستند ، از جمله داشتن ژن های MHC ارتولوگ (Adams et al.، 2001) و شباهتهای موجود در گیرنده های ایمونوگلوبولین مانند سلول های کشنده (KIR) با انسان ها (Bimber et al.، 2008؛ Parham et al.، 2010) ، نخستی های غیرانسانی (NHPs) مناسب ترین مدل برای رسیدگی به اثر درمانی ، ایمنی و ایمنی زایی سلول های لنفوسیت های T مشتق شده از PSC خواهد بود.

در اینجا ، ما یک روش بهبود یافته برای استخراج سلول های T از انسان و NHP-PSC با راندمان بالاتر و زمان کوتاهتر (به محض 3 هفته) از پروتکل های موجود را شرح می دهیم.

تمایز سلول های T از hPSC شامل دو مرحله اصلی است: القای سلول های پیش ساز خونساز (HP) از hPSCs و تمایز متعاقب آنها در سلول های  T  است. آزمایشگاه ما قبلاً از پروتکل های به خوبی تثبیت شده در مورد القای سلسله خون ساز از hPSCs در فیدرهای OP9 و در شرایط مشخص شده فیدر و سرم گزارش نکرده است (Vodyanik et al.، 2005؛ Vodyanik and Slukvin، 2007؛ Uenishi et al.، 2014) .

ما نشان دادیم که اجداد هموژنیک از مراحل مختلف تمایز یا منابع مختلف در OP9-DLL4 برای تمایز به سلول های T کشت داده شدند (Kumar et al.، 2019b). ما همچنین پروتكلی را برای القاء رده های خون ساز از NHP-PSC گزارش داده ایم (D’Souza و همكاران ، 2016).

تمایز لنفوسیت های T از هردو hPSCs یا NHP-PSC از طریق یک مرحله پیش ساز CD5 + CD7 + که در نهایت به سلول های CD8 + CD4 + دو مثبت منتقل می شود ادامه می یابد. درمجموع ، پروتکل مورد استفاده برای سلول های T مشتق شده از PSC ، بستری را برای تولید سلول های T فراهم می کند

تا بتواند ابزار آنها را برای ایمونوتراپی های فرزند خواندگی و آزمایش بالینی در مدل های بزرگ حیوانات ارزیابی کند.

مواد و شناساگرها

سل لاین

hESC WA01 -و WA09 ، WiCell

Ipsc- های بدون ترانس ، DF-19-9-7T و 4-3-7T33

-فیبروبلاست جنینی موش

-PSC های اولیه غیر انسانی (NHP-iPSCs)

– OP9  سل لاین  استرومای مغز استخوان موش

-سل لاین Lenti-XTM 293T

معرف ها

-α-MEM پایه پایه ،

-DMEM مخلوط مواد مغذی F-12

-پودر DMEM

-Iscove’s  اصلاح شده Dulbecco متوسط ​​(IMDEM)

-مخلوط مغذی ( F-12 Ham (F12

-کنسانتره لیپیدی شیمیایی (CDLC)

-GlutaMax

-اسیدهای آمینه غیر ضروری (NEAA)

-DPBS پودر شده ، بدون کلسیم و منیزیم

-EDTA 0.5 M

-جایگزینی سرون (KnockOut KOSR) برای

-کلاژناز نوع IV

-پرومایسین

-محیط  کشت سلول ES Primate

-mTeSR1

-محیط ( TeSR-E8 (E8)

-(Vitronectin XFTM (VTN)

-سدیم سلنیت Millipore Sigm

– Tenascin C

– (Collagen IV (CollV

– اسید استیک

– هولو ترانسفرین

-کلرید لیتیم

– 7-آمینوآکتینومایسین

-انسولین انسانی

-مونوتیو گلیسرول

-HEPES

-دکستروز

– 2-مرکاپتواتانول

-ژلاتین از پوست خوک

-هگزادیمترین بروماید ، پلی برن

-سرم گاو جنین ، تعریف شده

– تریپسین 0.05٪ / EDTA 0.5

– Recombinant Human Flt3

– نوترکیب FGF انسانی اساسی

– فاکتور سلول های بنیادی نوترکیب انسانی

-نوترکیب Human Activin A

– نوترکیب انسانی اینترلوکین 3 (IL-3)

– ترومبوپویتین نوترکیب انسانی

-اینترلوکین انسانی نوترکیب 6 (IL6)

-پروتئین مورفوژنیک 4 استخوان انسانی نوترکیب

-فاکتور رشد اندوتلیال عروقی نوترکیب انسانی

-نوترکیب انسانی اینترلوکین 7 (IL7)

بازدارنده GSK-3β (CHIR99021)

– ماتریژل واجد شرایط سلول ES انسانی

– کلرید کلسیم (CaCl2)

-کلرید پتاسیم (KCl)

-سدیم کلرید (NaCl)

-بی کربنات سدیم

-سدیم آزید ، NaN3

-کسر BSA V

-سدیم فسفات دیباستیک بی آب (Na2HPO4)

-پلی وینیل الکل (PVA)

-داکسی سایکلین (DOX)

-آنتی بادی ها (جدول 1)

مواد

-کلریدر سلولی ، 40 میکرومتر

-کلریدر سلولی ، 70 میکرومتر

-9 pip پیپ پاستور ، شیشه فلینت

-پیپت های سرولوژیکی 10 میلی لیتر

-پیپت های سرولوژیکی  میلی لیتر

-فیلتر بالای بطری یکبار مصرف نالژن ، غشای پلی اترسولفون با اندازه منافذ 0.2

-لوله میکروسانتریفیوژ 0.5 میلی لیتر ، قابل اتوکلاو

-پیپت سرولوژیکی ، 1 میلی لیتر غیر آندروژنیک

-پیپت شیشه ای Borosilicate ، 5 میلی لیتر

-5 میلی لیتر لوله پایین پلی استایرن ، 75 12 12 میلی متر ، غیر استریل

-ستون های جداسازی MACS

-MACS Multistand

-فیلترهای جداسازی  30 میکرومتر

-ظروف کشت بافت ، پلی استایرن 100 × 20 میلی متر

-پلیت 6 چاهی کشت بافت ، کف صاف پلی استایرن

-لوله های مخروطی پلی پروپیلن 15 میلی لیتری

-لوله های مخروطی 50 میلی لیتر  پلی پروپیلن

-واحدهای فیلتر تصفیه استری فلیپ ، 50 میلی لیتر سیستم فیلتر خلاء با غشاء اندازه منافذ 0.22 میکرومتر

-پیپت سرولوژیک ، 5 میلی لیتر غیر آندروژنیک

-پیپت سرولوژیک ، 10 میلی لیتر غیر آندروژنیک

-دستکش های بدون پودر استرلینگ نیتریل xtra

محیط کشت و محلول ها برای تولید لنفوسیت های T

-محیط رشد انسانی PSC  ​​

-محیط رشد MEF

-NHP-iPSC Primate PSCs Medium

-ماوس OP9 / OP9-DLL4 محیط کشت سلول استرومایی مغز استخوان

-تمایز خون ساز انسان محیط کوکتوری OP9

-محیط تمایز NHP

– استوک محیط IF4S

-محلول استوک   5XPVA

-IF9S محیط

-محیط تمایزی لنفاوی

-محلول نمکی HBS (2 برابر

-محلول( CaCl2) (2 M)

-محلول ژلاتین (0.1٪ وزنی بر حجم)

-بافر مرتب سازی سلول های مغناطیسی (MACS)

-بافر جریان سیتومتری

-بازسازی سیتوکین ها

-محلول کلاژناز (1 میلی گرم در میلی لیتر)

-داکسی سایکلین (1 میلی گرم در میلی لیتر)

تجهیزات

-آنالایزر MACSQuant

-شمارنده زنده ماندن سلول CellometerR Auto

-هموسیتومتر

-MACSmix Tube Rotator

-بن ماری

-سانتریفیوژ

-میکروسانتريفيوژ

-فیلتر سانتریفیويژ

-هود استریل

-انکوباتور

-انکوباتور هیپوکسی

-میکروسکوپ معکوس با لنزهای هدفمند

-ترازو

-Pipet-Aid

-سیستم دفع مواد زائد مایع برای آسپیراسیون

-اولتراسانتریفیوژ

نرم افزار برای تولید لنفوسیت های T

1. (FlowJo^TMsoftware (v10.6.1) )
2. GraphPad Prism 7

ادامه دارد ………………………………